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Harasim, Thomas (2009): Die Rolle des nucleostemin-Gens in dem Prozess der Ribosomenbiogenese. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Biogenese von Ribosomen ist Voraussetzung für die Neusynthese von Proteinen und somit auch für Zellwachstum unabdingbar. In den Nukleoli der Zellen muss eine Vielzahl von Ribosomenbiogenese-Faktoren funktionell reguliert und koordiniert werden, damit reife 40S- und 60S- ribosomale Untereinheiten entstehen. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, wie das nucleostemin (nst) Gen an dem zellulären Prozess der Ribosomenbiogenese partizipiert. Zur Beantwortung dieser Frage wurden mehrere Punkt- und Deletionsmutanten von nst kloniert, exprimiert und zuerst auf ihren intrazellulären Lokalisationsphänotyp hin überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend nukleoläre Lokalisation von NST durch den N-Terminus des Proteins, bestehend aus der basischen- und Coiled-Coil Domäne, vermittelt und durch zirkulär permutierte GTP-Bindemotive reguliert wird. Die Überexpression der nst Mutanten verursachte des Weiteren keine nukleoplasmatische Translokation des nukleolären Stressdetektorproteins Nucleophosmin (B23). Ein weiterer Überexpressionsphänotyp des nst Wildtyp-Gens ist eine signifikante Proliferationserhöhung in p53-positiven Zellen. Ein knock-down von nst resultiert in einer deutlichen Proliferationsinhibition von p53 positiven- als auch p53 negativen Zellen und einem p53 vermittelten G1/S-Phase Zellzyklusarrest. Auf Ebene der ribosomalen RNA induziert die temporäre Herabregulation von nst einen 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt, welcher in verringerten de novo prozessierten 28S rRNA Mengen resultiert. In einem miRNA/siRNA basierten knock-down knock-in Experiment wurde der N-Terminus des Proteins zudem als minimale Funktionseinheit identifiziert: die Expression einer Mutante, bestehend aus der basischen und Coiled Coil Domäne, konnte den durch RNAi induzierten 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt kompensieren. Der N-Terminus von NST sedimentiert zudem in einem Sucrose-Gradienten in Wildtyp-ähnlicher Manier, im Gegensatz zu einer NST Proteinvariante, welcher dieser Teil des Proteins fehlt. Eine Interaktion des NST-Proteins mit dem PeBoW-Komplex oder dem p53 Regulator Hdm-2 konnte nicht gezeigt werden. Diese Arbeit beschreibt somit NST als 32S rRNA-Prozessierungsfaktor und definiert den N-Terminus des Proteins als minimale Funktionseinheit während der Ribosomenbiogenese.