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Dettmar, Kirsten (2003): Vergleichende Etablierung und Charakterisierung eines orthotopen Kolonkarzinom-Xenograft-Modells. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The human colon cancer cellline HT29 was investigated in various models regarding different criteria. The in-vivo-experiments were carried out with female SCID mice and consisted of subcutaneous cell injection, orthotopic cell injection into the cecal wall and orthotopic fixation of a tumor fragment onto the cecum. The subcutaneous experiment took 41 days; the orthotopic animal experiments were equally divided into three points of necropsy each two weeks apart. On these days tumor, liver and lung were withdrawn, fixed in 3,8% formaldehyde and analyzed histologically. In addition blood samples of all animals of the orthotopic experiments were taken on days of autopsy and the CEA (carcinoembryonic antigen) content was determined using an ELISA. The vascularization of the orthotopic primary tumors was examined by staining of CD34, i.e. number and area of the tagged vessels were ascertained. Additionally the green fluorescent protein (GFP) was studied in view of its suitability as quantifiable reporter gene in these models. Therefore not only HT29-wildtype but also HT29 cells transfected with GFP were used in vitro and in the first two in vivo assays. Advantages and disadvantages summarized: - The subcutaneous model was realized easily, measurement of the primary tumor was simple, the tumor take rate was 100 % and the laboratory animals appeared to suffer only from a relative slight amount of stress. Besides these advantages this setting cannot be used for investigations regarding metastasis because of the low number of metastases. - The orthotopic cell injection generated small, hardly measurable primary tumors, but this approach is a suitable model of metastasis because of the number of metastases detected. The technical effort and the burden for the animals exceeded that found in the subcutaneous setting but was below the effort of orthotopic fixation of a tumor fragment. - Of all investigated models the orthotopic fixation of a tumor fragment represents the model with the greatest effort. The primary tumors were big enough to be measured, but the number of metastases was too low to make statistical valuable evaluations. - The CD34 staining successfully marked the vessels of the primary tumor and facilitated a computer-assisted quantitative analysis of the vascularization of orthotopic colon tumors. It was assessed that a broad neoangiogenesis occurred at the beginning of tumor growth prior to the development of metastases. The number of metastases increased with proceeding length of time, whereas the number of vessels decreased. The continuous extension in tumor volume resulted in a necrotic tumor center so that vessels were detectable in the border area only. - The used HT29-GFP clone was not stable enough to generate sufficient fluorescence. The cells both in vitro an in vivo grew more slowly, the subcutaneous tumors showed necrotic areas and there were less metastases after orthotopic injection of GFP cells than after injection of wildtype cells. Because of the insufficient fluorescence it was not possible to execute a quantifiable analysis of metastasis. The application of GFP was not advantageous within these models. - CEA suits to be a valuable tumor marker for colon cancer in both investigated models. The CEA content in the blood samples of tumor bearing animals increased dependent on tumor burden and tumor invasiveness. A direct correlation between tumor size and CEA might be established with an improved measurement system or rather an advanced measuring of tumor volume. Due to the comparative characterization of injection and implantation techniques as well as other detailed examinations carried out for this thesis, it is possible to select suitable models for preclinical trials depending on the individual purpose.

Abstract

Die humane Kolonkarzinomzelllinie HT29 wurde in verschiedenen Modellen hinsichtlich unterschiedlicher Kriterien eingehend untersucht. Die in vivo-Versuche wurden an weiblichen SCID-Mäusen durchgeführt und bestanden aus subkutaner Zellinjektion, orthotoper Zellinjektion in die Wand des Caecums und orthotoper Fixation eines Tumorfragments am Caecum. Der subkutane Versuch dauerte 41 Tage, die orthotopen Tierexperimente hatten jeweils drei Tötungszeitpunkte mit einem Abstand von je zwei Wochen. Es wurden jeweils Tumor, Leber und Lunge entnommen, in 3,8%igem Formaldehyd fixiert und histologisch untersucht. Den Tieren der orthotopen Versuche wurde zusätzlich am Sektionstag Blut entnommen und mittels ELISA sein CEA (Carcinoembryonales Antigen) - Gehalt bestimmt. Die Vaskularisierung der orthotopen Primärtumoren wurde anhand einer CD34-Färbung quantitativ ausgewertet, d.h. Anzahl und Fläche der markierten Gefäße wurden bestimmt. Zudem wurde noch das grün fluoreszierende Protein (GFP) auf seine Eignung als quantifizierbares Reportergen in diesen Modellen überprüft. So wurden neben den Wildtyp-Zellen auch GFP-transfizierte HT29-Zellen in vitro und in den ersten beiden in-vivo-Experimenten eingesetzt. Vor- und Nachteile zusammengefasst: - Das subkutane Modell war leicht durchführbar, der Primärtumor einfach zu vermessen, die Anwachsrate lag bei 100 % und die Belastung der Versuchstiere ist als relativ gering einzustufen. Allerdings eignet sich dieser Ansatz aufgrund der geringen Metastasenanzahl nicht als Metastasierungsmodell. - Die orthotope Zellinjektion brachte sehr kleine, schlecht messbare Primärtumoren hervor, jedoch eignet sich dieser Ansatz aufgrund der Metastasenanzahl gut als Metastasierungsmodell. Der Aufwand und die Tierbelastung waren höher als bei subkutaner Injektion, jedoch niedriger im Vergleich zur orthotopen Fragmentfixation. - Die orthotope Fragmentfixation stellt das aufwendigste aller untersuchten Modelle dar. Die Primärtumoren waren groß genug, um vermessen zu werden, allerdings war die Metastasenanzahl zu gering, um eine statistisch abgesicherte Aussage treffen zu können. - Die CD34-Färbung markierte erfolgreich die Gefäße des Primärtumors und ermöglichte somit eine Computer-unterstützte quantitative Auswertung der Vaskularisierung der orthotopen Darmtumoren. Es konnte festgestellt werden, dass zu Beginn des Tumorwachstums, eine ausgeprägte Neoangiogenese stattfindet, die der Metastasenentwicklung vorausgeht. So stieg die Metastasenanzahl mit zunehmender Versuchsdauer an, die Gefäßanzahl nahm jedoch ab. Grund dafür ist die stetige Volumenvergrößerung der Tumoren, so dass ihr Zentrum nekrotisch wurde und Gefäße nur noch im Randbereich detektiert werden konnten. - Der verwendete HT29-GFP-Klon war nicht stabil genug, um eine ausreichende Fluoreszenz hervorzubringen. Zudem wuchsen die Zellen sowohl in vitro als auch in vivo langsamer, die subkutanen Tumoren zeigten vermehrt nekrotische Bereiche, und es entstanden weniger Metastasen nach orthotoper GFP-Zellinjektion als nach Wildtyp-Zellinjektion. Eine Quantifizierung im Rahmen der Metastasenauswertung mit Hilfe von GFP konnte aufgrund der unzureichenden Fluoreszenz nicht durchgeführt werden. Der Einsatz von GFP hat in diese Modellen keinen Vorteil gebracht. - CEA zeichnete sich als wertvoller Tumormarker für Darmtumoren in beiden untersuchten orthotopen Modellen aus. Abhängig von steigender Tumorbelastung und zunehmender Invasivität der Tumoren nahm auch der CEA-Gehalt im Blut der Versuchstiere zu. Mit einem verfeinerten Meßsystem bzw. einer verbesserten Volumenmessung der Tumoren, könnte eine direkte Korrelation zwischen Tumorgröße und CEA hergestellt werden. Durch die in der vorliegenden Arbeit duchgeführte vergleichende Charakterisierung verschiedener Injektions- und Implantationstechniken sowie weiterführender Untersuchungen, lassen sich je nach Fragestellung geeignete Modelle für die präklinische Wirkstoffprüfung auswählen.