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Schilling, David (2003): Stress and Growth Related Keratinocyte Pathways: Investigation of the Novel Immediate Early Gene IEX-1 in Primary Human Keratinocytes and the HaCaT Human Keratinocyte Cell Line. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Cellular stress and damage response mechanisms play a crucial role in physiological defense against hyperproliferative diseases, genotoxic injury, mutations and malignancy. An important first step in the cellular stress response is upregulation of immediate early genes that initiate and coordinate subsequent cellular events. IEX-1 is a novel immediate early gene that has been shown to be induced by gamma irradiation, phorbol ester treatment and ultraviolet irradiation. Goal of this thesis was to more specifically characterize the role of IEX-1 in keratinocytes. Special emphasis was directed to elucidating the cellular response to stress and mitogenic stimulation and the role of IEX-1 in mediating apoptosis as well as localizing the protein within the cell during these events. By northern blot analysis, it could be shown that gamma irradiation of primary human keratinocytes results in a time dependent, rapid induction of IEX-1 expression followed by prompt downregulation, similar to previous findings in a squamous cell carcinoma cell line. In addition, UV-irradiation or treatment with the reactive oxygen species hydrogen peroxide also induced IEX-1 expression rapidly and transiently. Further incubation with the mitogenic factor for keratinocyte Epidermal Growth Factor (EGF) resulted in increased steady state levels of IEX-1 mRNA. Compared to normal keratinocytes, similar observations were made in the non-tumorigenic keratinocyte cell line HaCaT. Regulation of IEX-1 gene expression by the EGF-Receptor (EGFR) was investigated using an IEX-1-promoter-luciferase-reporter-gene assay and blockage of EGFR by the highly specific EGFR-tyrosine kinase inhibitor PD153035. Blockage of the receptor was followed by a marked decrease in IEX-1 promoter activity. Effects of IEX-1 overexpression in HaCaT cells were investigated. IEX-1 overexpression enhanced proliferation, as confirmed by [3H]-thymidine incorporation assay. To examine the effects of IEX-1 on apoptosis induced by various agents, IEX-1 over-expressing HaCaT were challenged with ultraviolet radiation, the DNA damaging agent camptothecin or serum-deprival. Cell survival, caspase 3-activity and nucleosome formation were measured to assess apoptosis. There was no difference observed in baseline apoptotic activity of cells cultured under non-stressed conditions, when comparing the IEX-1 overexpressing and the control cell line. However, upon stress-induction, the IEX-1 overexpressing cells showed markedly higher levels of apoptosis. Data characterizing the intracellular localization of IEX-1 were obtained by immunohistochemical staining as well as by molecular biological methods. IEX-1 was predominantly located within the cell nucleus, forming several intranuclear patches. Treatment with various stress-inducing agents did not significantly alter the localization or cause translocation of the IEX-1 protein. Distribution of IEX-1 within the skin and epidermis was assessed by immunocytochemistry of human skin specimens and revealed predominant localization of IEX-1 within the nucleus and cytoplasm of the basal epidermal and suprabasal layers. These findings implicate IEX-1 in the control of apoptosis upon cell stress as well as promotion of cell replication during favorable growth conditions. The function of IEX-1 seems to be closely linked to the differentiation status of the keratinocyte. As an immediate early gene product, IEX-1 is a novel regulator of keratinocyte growth and survival, similar to other critical cell cycle control proteins, such as p53, p21Waf1, c-myc and related proteins. This suggests that IEX-1 is another crucial element in the pattern of regulatory pathways of cell growth and defense against malignant transformation.

Abstract

Zelluläre Mechanismen als Antwort auf Zellstress oder Zellschäden spielen eine wesentliche Rolle in der physiologischen Verteidigungsstrategie gegen hyperproliferative Krankheiten, genotoxische Schäden, Mutationen oder maligne Entartung. Die Expression von Immediate Early Genen, die nachfolgende zelluläre Ereignisse initiieren und koordinieren, ist ein wichtiger erster Schritt der zellulären Stressantwort. IEX-1 ist ein vor kurzem entdecktes Immediate Early Gen, von dem gezeigt werden konnte, dass es durch die Einwirkung von Gammastrahlen, Phorbolestern und Ultraviolettstrahlung induziert wird. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von IEX-1 in der Stressantwort von Keratinozyten genauer zu charakterisieren. Nicht nur die zelluläre Antwort auf Stress, sondern auch die mitogene Stimulation und die Rolle von IEX-1 in Bezug auf Apoptosereaktionswege sollten untersucht werden. Weiteres Interesse galt der Analyse der IEX-1-Proteinlokalisation während dieser Ereignisse. Mit Hilfe des Northern Blot Verfahrens konnte gezeigt werden, dass IEX-1 nach Gamma-Bestrahlung von primären menschlichen Keratinozyten innerhalb von Minuten induziert und dann sehr rasch wieder herunter geregelt wird, ähnlich wie schon zuvor mit einer Keratinozyten-Tumorzelllinie gezeigt wurde. Außerdem bewirkte UV-Strahlung und Behandlung mit reaktiven Sauerstoffradikalen eine rasche, aber vorübergehende Induktion von IEX-1. Zusätzlich rief die Inkubation der Keratinozyten mit epidermal growth factor (EGF) erhöhte steady state Spiegel von IEX-1 mRNA hervor. Ähnliche Beobachtungen konnten an der HaCaT-Zelllinie, einer nicht-tumorigenen Keratinozytenlinie gemacht werden. Die Regulation der IEX-1-Genexpression durch den epidermal growth factor-Rezeptor (EGFR) wurde mittels eines IEX-1-Promotor – Luciferase Assays untersucht. Dabei wurde der EGF-Rezeptor mit dem hochspezifischen EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor PD153035 blockiert. Der Rezeptorblockade folgte ein starker Rückgang der IEX-1-Promotoraktivität. Die Auswirkungen der Überexpression von IEX-1 in HaCaT-Zellen wurde untersucht. Wachstumsstudien mit [3H]-Thymidin-Inkorporationsassays ergaben, dass IEX- Überexpression das Wachstum beschleunigt. Um die Auswirkungen von IEX-1 auf die Apoptose zu untersuchen, wurden IEX-1 überexprimierende HaCaT-Zellen mit ultravioletter Bestrahlung, dem DNA-toxischen Agens Captothecin oder Serumentzug behandelt. Die Apoptoserate wurde mittels Caspase-3-Enzymaktivität und Oligonucleosomenbildung im Zellplasma quantifiziert. Die entsprechenden Assays konnten erstmalig für adhärente Keratinozytenkulturen etabliert werden. Unter normalen Wachstumsbedingungen ohne Stress konnte kein Unterschied in der basalen Apoptoserate zwischen IEX-1-überexprimierenden Zellen und Kontrollzellen beobachtet werden. Wurden die Zellen jedoch Stress ausgesetzt, dann trat in den IEX-1-überexprimierenden Zellkulturen in erhöhtem Maße Apoptose auf. Das IEX-1-Protein konnte mit immunhistochemischen sowie molekularbiologischen Methoden vorwiegend im Zellkern lokalisiert werden, wo es sich in unterschiedlicher Verteilung zeigte. Stressinduzierende Behandlung der Zellen konnte keine Translokation des Proteines oder eine Veränderung im Verteilungsmuster bewirken. Untersuchung an menschlicher Epidermis mittels immunhistochemischer Färbung zeigte, dass IEX-1 hauptsächlich in den basalen und suprabasalen Schichten der Epidermis exprimiert wird. Mit diesen Ergebnissen konnte erstmals gezeigt werden, dass IEX-1 eine wichtige Rolle sowohl in der Kontrolle der Apoptose als Folge von Zellstress, als auch in der Vermittlung von Zellreplikation unter optimalen Wachstumsbedingungen zukommt. Die Wirkung von IEX-1 scheint dabei eng an den Differenzierungsstatus der Keratinozyten gebunden zu sein. Als Produkt eines Immediate early Gens spielt IEX-1 eine Rolle in der Vermittlung von Keratinozytenwachstum und Keratinozytenüberleben, ähnlich wie die wichtigen Zellzyklusproteine p53, p21Waf1,c-myc und andere verwandte Proteine. Damit zeichnet es sich als ein weiterer elementarer Baustein im Mosaik der Reaktionswege zur Regulierung von Zellwachstum und Bekämpfung von maligner Entartung ab.