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Odenbach, Tina (2009): Charakterisierung der Hybridsensorkinase LuxN und des Antwortregulators LuxO des Quorum sensing-Systems in Vibrio harveyi. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Signaltransduktionskaskade des komplexen Quorum sensing-Systems in Vibrio harveyi umfasst die drei Hybridsensorkinasen LuxN, LuxQ und CqsS, das Histidinphosphotransferprotein LuxU und den Antwortregulator LuxO. Bei niedriger Zelldichte funktionieren die Hybridsensorkinasen als Autokinasen. Die Phosphorylgruppe wird zunächst intramolekular übertragen und anschließend auf LuxU und LuxO weitergeleitet. Phosphoryliertes LuxO aktiviert die Expression von fünf regulatorischen RNAs, die im Zusammenspiel mit dem RNA-Chaperon Hfq die Translation der mRNA des Masterregulators LuxR inhibieren. Bei hoher Zelldichte wird die Kinaseaktivität der Hybridsensorkinasen durch die jeweiligen Autoinduktoren (LuxN: HAI-1, LuxQ: AI-2, CqsS: CAI-1) inhibiert, sodass es zum Abschalten der Phosphorylierungskaskade und zur Anreicherung von LuxR kommt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine LuxN und LuxO biochemisch näher charakterisiert. Mit Hilfe diverser Methoden konnte die Topologie des Membranproteins LuxN, zusammen mit der Lage des N-Terminus, gelöst werden: das Protein besteht aus neun Transmembrandomänen mit einem periplasmatisch lokalisierten N-Terminus. Im Zuge der biochemischen Charakterisierung von LuxN wurden zwei an der Bindung des Autoinduktors HAI-1 beteiligte Aminosäuren identifiziert. Das Membranprotein LuxN wurde erfolgreich gereinigt und in Escherichia coli- und V. harveyi-basierten Proteoliposomen rekonstituiert. Ebenso wurde der in Form von Inclusion Bodies heterolog in E. coli überproduzierte Antwortregulator LuxO gereinigt und renaturiert. Das renaturierte Protein konnte erstmalig mit dem niedermolekularen Phosphodonor [γ-32P]-Acetylphosphat markiert werden und eine Bindung an die DNA in phosphorylierter und nicht-phosphorylierter Form im Bereich der hypothetischen σ54- und LuxO-Bindestelle gezeigt werden.